2011-2012 절기 국내 실험실 감시를 통한 인플루엔자 항바이러스제 내성 양상 분석
Antiviral drugs resistance of influenza viruses isolated in Korea during 2011-2012 season
질병관리본부 국립보건연구원 감염병센터 인플루엔자바이러스과
최장훈 김수진 김남훈
Ⅰ. 들어가는 말
인플루엔자바이러스는 매년 크고 작은 유행을 일으켜 호흡기 감염증을 유발시키며 특히 유아, 노약자 및 만성질환자에서 폐렴 등 합병증으로 인한 입원 또는 사망률 증가를 초래하고 있다.
인플루엔자바이러스 감염의 효과적인 예방은 백신을 접종하는 것이나 항원변이로 인한 백신주와 실제 유행주와의 불일치로 인하여 효능이 떨어질 수 있다. 인플루엔자바이러스에 대한 항바이러스제는 M2(이온채널) 억제제인 amantadine(상품명 아만타딘) 과 NA(뉴라미니다제) 억제제인 oseltamivir(상품명 타미플루) 및 zanamivir(상품명 릴렌자)가 대표적이고 발증 초기에 사용할 경우 증상을 완화시키고 발열기간을 단축시키는 효과적인 환자관리 수단이 된다. 2005년 이후 amantadine에 대한 내성주가 지속적으로 증가 하여 최근 유행하는 인플루엔자 A(H3N2) 및 A(H1N1)pdm09 등 A형 바이러스는 모두 amantadine 내성을 보인다[1, 2]. 2009년 대유행 이전 국내 분리 계절인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 분리주는 모두 oseltamivir에 대한 내성 (99.8%)을 보였으나 현재 유행하는 A(H3N2) 바이러스는 감수성을 보이며 2009년 대유행 원인 바이러스인 A(H1N1)pdm09 바이러스는 2010년 9월부터 2011년 3월까지 일부 내성주가 보고된 바 있다(Figure 1). 이 내성주들은 모두 NA 유전자의 275번째 아미노산이 히스티딘(Histidine; H)에서 타이로신(Tyrosine; Y)으로 치환된 변이를 보였다. 국내에서도 2009년 이후 중증자 및 항바이러스제 무반응자에서 oseltamivir 내성인 A(H1N1)pdm09 바이러스 검출을 11예의 검출을 보고한 바가 있다[3, 4].
질병관리본부 인플루엔자바이러스과는 국내 인플루엔자 및 호흡기바이러스 실험실감시(Korea Influenza and Respiratory viruses Surveillance System, KINRESS)를 통하여 확보된 인플루엔자바이러스 국내 분리주를 대상으로 항바이러스제 중 M2 억제제와 NA 억제제에 대한 내성 감시체계를 연중 운영하고 있다. 이 중 2011-2012 절기 동안 국내 유행 계절 및 2009년형 A(H1N1)pdm09 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스제 내성 양상 분석을 통하여 효율적인 인플루엔자 관리 및 임상 과학적 근거자료를 제공하고자 한다.
Ⅱ. 몸말
국내 유행 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스제 내성 분석을 위하여 2011-2012 절기(2011.9. 1-2012 .8 .31) ‘인플루엔자 및 호흡기바이러스 실험실감시사업’을 통해 확인된 검체 3,785건 중 발생 시기별, 지역별, 바이러스 아형을 고려하여 무작위 표본추출법으로 선정 후 MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 세포주를 이용하여 총 1,162주의 바이러스를 분리하였다[A(H1N1)pdm09 1건, A(H3N2) 615건, B 546건]. 이중 A형 바이러스 616주에 대해서는 M2 및 NA 억제제에 대한 내성 양상을 분석하였고, B형 546주에 대해서는 NA 억제제에 대한 내성 양상만 분석하였다(B형 바이러스는 M2 유전자가 존재하지 않음).
인플루엔자 항바이러스제 내성은 알려진 유전형 분석법(genotypic assay)과 표현형 분석법(phenotypic assay)을 모두 적용하여 분석하였다. M2 억제제에 대한 내성 유전형 분석을 위하여 A형 인플루엔자바이러스 M2 유전자를 RT-PCR로 증폭 후에 대한 염기서열분석을 통하여 amantadine 내성 관련 부위로 알려진 5개 변이(L26F, V27A, A30T, S31N, G34E)를 중심으로 아미노산 변이를 조사하였다. NA 억제제에 대한 내성 유전형 분석 역시 NA 유전자를 RT-PCR로 증폭 후 염기서열 분석을 통하여 내성 관련 아미노산 부위(E119V, R152K, D199N, S247N, H275Y, R293K 및 N295S)를 중심으로 아미노산 변이를 조사하였다. NA 억제제에 대한 표현형 분석은 화학발광(chemi luminescence) 기질을 이용하는 NA-StarⓇ kit(ABI사)를 이용하여 뉴라미니다제억제분석법 (Neuraminidase Inhibition Assay, NAI)으로 NA억제제에 대한 IC50 값을 조사하였다.
NA 억제제에 대한 유전형 분석을 통한 내성양상을 조사한 결과, 총 1,162건 [A(H1N1)pdm09 1주, A/H3N2 615주, B 546주] 모두 내성과 관련된 변이가 확인되지 않아 감수성으로 확인되었다. 2010-2011절기에는 oseltamivir 내성 A(H1N1)pdm09형 바이러스가 중증자와 실험실 감시에서 각각 1건씩 검출 되었으나, 이번 절기에는 A(H1N1)pdm09형 바이러스 검출이 총 1건으로 발생빈도가 극히 적었고 그 또한 감수성으로 나타났다. 2011-2012 절기에 주로 유행한 A(H3N2) 및 B형 바이러스에서는 내성주가 확인되지 않았다(Table 1).
NA 유전자 염기서열 분석결과 알려진 NA 억제제 내성 변이를 포함하지 않은 분리주 중에서 시기별 무작위 표본 추출한 A(H3N2) 107주와 B형 93주를 대상으로 NA 억제제(oseltamivir 및 zanamivir)에 대한 표현형 분석을 실시한 결과, A(H3N2) 107주는 oseltamivir에 대한 IC50 값이 0.042 – 2.731 nM 범위로(평균; 0.305 nM), zanamivir에 대한 반수억제농도(IC50) 값이 0.14 – 20.83 nM (평균: 2.774 nM)으로 모두 감수성 이었고, B형 93주 또한 oseltamivir에 대한 IC50 값이 0.112 – 12.66nM(평균: 2.784 nM), zanamivir에 대한 IC50 값이 1.324 – 12.68 nM(평균 7.956 nM)로 모두 감수성이었다. 이중 2개의 A(H3N2)형 분리주는 같은 절기 내 zanamivir에 대한 감수성이 통계적으로 유의하게 감수성주와 차이는 나지 않아 감수성주로 판단되었으나 분리주 평균 IC50 값보다 약 10배 정도로(IC50 20.83, 19.14 nM) 감수성이 감소된 것으로 확인되었다. 이는 바이러스 성장 억제 분석(plaque reduction assay) 등의 추가적인 NA억제제에 대한 감수성 분석을 수행 할 필요성이 있다(Table 2).
반면, M2 억제제에 대한 내성 유전자 분석결과, A형 바이러스 616주 [A(H1N1)pdm09 1주, A/H3N2 615주] 모두 내성으로 확인 되었다. amantadine 내성주 모두에서 M2 유전자 아미노산 27번이 valine에서 Isoleucine로, 31번이 serine에서 asparagine으로 치환되었으며, 아미노산 나머지 26, 30 및 34번째 위치에서는 아미노산 변이가 나타나지 않았다. 2010-2011절기까지 M2 유전자 아미노산 31번의 변이가 주로 나타났으나 2011-2012절기의 분리주에서 27번 아미노산의 변이가 추가적으로 발생하였으나 내성관련 변이인 alanine이 아닌 isoleucine으로 치환되었음을 확인하였고 내성과 연관성에 대해서는 추가적인 연구가 필요하다(Figure 2).
Ⅲ. 맺는말
2005년 이후 국내 M2 억제제(아만타딘)에 대한 내성률이 증가하여 현재 유행하는 대부분의 인플루엔자 A 바이러스가 내성을 보이는 반면에 NA 억제제는 낮은 내성률과 oseltamivir와 zanamivir 간에 교차 내성이 적은 관계로 인해 현재 인플루엔자 치료 및 예방에 널리 사용되고 있다[2]. 그러나 2008년 이후 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 oseltamivir내성 계절 A(H1N1)형 바이러스가 유행하였으나(2008년 12월 기준 99.8%) 2009년 H1N1pdm09 바이러스 대유행이후에는 더 이상 유행하지 않았다[4]. 2009년 H1N1pdm09 바이러스의 경우 전 세계적으로 1.5%의 낮은 oseltamivir 내성률을 보였고[5] 국내에서도 치료제 투여 후에도 호전되지 않는 중증자 집단에서 11례를 확인된 바 있다[3]. 2010-2011 절기 지역사회 실험실 감시를 통해서는 1례를 처음 확인하였으나 현재까지는 추가적으로 확인된 사례는 없었다. 또한, 기존에 알려진 내성 유발 변이 외에도 S247N 변이 등과 같은 새로운 변이가 계속 발생할 수 있고 과거의 계절인플루엔자 A(H1N1) 바이러스와 같이 급격하게 증가하기 전에 나타나는 내성 바이러스의 적응을 돕는 변이(viral fitness helping mutation) 분석도 병행 되어야 할 것이다[6, 7].
종합적으로 2011-2012 절기 동안 국내 인플루엔자 바이러스 유행주에 대한 내성 양상 조사 결과, A형 바이러스는 M2억제제(amantadine)에 대하여 모두(100%) 내성이었으며, NA 억제제(oseltamivir 및 zanamivir)에 대해서는 모두(100%) 감수성으로 나타났다. 이는 현재까지 NA억제제가 인플루엔자 치료제로서 유효함을 알 수 있다. 그러나 향후 내성분석 감시 대상군을 확대하고 새로운 분석기법 개발 및 도입으로 항바이러스제 내성감시체계를 강화하여 내성 바이러스를 조기에 탐지함으로써 효율적인 인플루엔자 관리 및 치료 정책 수립에 필요한 자료를 지속적으로 생산하는 것이 인플루엔자 항원형 변이주 추적과 병행하여 추진되어야 할 것이다.
Ⅳ. 참고문헌
1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC), 2006. High levels of amantadine resistance among influenza A (H3N2) viruses and interim guidelines for use of 166 antiviral agents-United States, 2005-06 influenza season..Morb.Mortal.Wkly.Rep. 55, 44-46.
2. Choi WY., Kim SJ., Lee NJ., et al., 2009. Amantadine-resistant influenza A viruses isolated in South Korea from 2003 to 2009. Antiviral Res 2009;84:199-202.
3. Yi HJ., Lee JY., Hong EH., et al., 2010. Oseltamivir-resistant infection of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus in South Korea. Emerg. Inf. Dis. 16(12) 1938-1942.
4. Choi WY., Yang IS., Kim SJ., et al., 2011.The emergence of oseltamivir-resistant seasonal influenza A(H1N1) virus in Korea during the 2008-2009 season. Public Health Res Perspect 2011 2(3), 178-185.
5. World Health Organization (WHO), Summary of influenza antiviral susceptibility surveillance finding, September 2010 – March 2011. 2011.6. 6.
6. Hurt AC, Lee RT, Keang SK, et al. 2011. Increased detection in Australia and Singapore of a novel influenza A(H1N1)2009 variant with reduced oseltamivir and zanamivir sensitivity due to a S247N neuraminidase mutation. Eurosurveillance 2011;16(23)1-6.
7. Bloom JD., Gong LI., Baltimore D. 2010. Permissive secondary mutations enable the evolution of influenza oseltamivir resistance. Science 2010; 328 (5938) 1272-1275.
